Прадукты
Набор для выяўлення SARS-Cov-2 у рэжыме рэальнага часу з дапамогай ПЦР Lifecosm для 2019-nCoV
Чаканае выкарыстанне
Гэты набор выкарыстоўваецца для якаснага выяўлення новага каранавіруса (2019-nCoV) з выкарыстаннем мазкоў з горла, мазкоў з насаглоткі, бронхаальвеалярнай прамыўной вадкасці, мокроты. Вынікі выяўлення гэтага прадукта прызначаны толькі для клінічнай даведкі і не павінны выкарыстоўвацца ў якасці адзінага доказу для клінічнай дыягностыкі і лячэння. Рэкамендуецца правесці ўсебаковы аналіз стану ў спалучэнні з клінічнымі праявамі пацыента і іншымі лабараторнымі тэстамі.
Прынцып праверкі
Набор заснаваны на тэхналогіі аднаэтапнай ПЛР у рэальнасці ў рэальным часе. Фактычна, у якасці мэтавых рэгіёнаў ампліфікацыі былі абраныя гены ORF1ab і N новага каранавіруса 2019 года (2019-nCoV). Спецыяльныя праймеры і флуарэсцэнтныя зонды (зонды гена N пазначаны FAM, а зонды ORF1ab — HEX) прызначаны для выяўлення РНК каранавіруса новага тыпу 2019 года ва ўзорах. Набор таксама ўключае эндагенную сістэму выяўлення ўнутранага кантролю (зонд гена ўнутранага кантролю, пазначаны CY5) для маніторынгу працэсу збору ўзораў, ампліфікацыі РНК і ПЛР, тым самым зніжаючы колькасць ілжываадмоўных вынікаў.
Асноўныя кампаненты
| Кампаненты | Аб'ём(48T/Камплект） |
| Раствор для рэакцыі RT-PCR | 96 мкл |
| Праймер nCOV Сумесь зондаў TaqMan（ORF1ab, ген N, ген RnaseP） | 864 мкл |
| Адмоўны кантроль | 1500 мкл |
| Станоўчы кантроль nCOV (ген ORF1ab N) | 1500 мкл |
Уласныя рэагенты: рэагенты для экстракцыі або ачысткі РНК. Адмоўны/станоўчы кантроль: станоўчым кантролем з'яўляецца РНК, якая змяшчае мэтавы фрагмент, а адмоўным кантролем — вада без нуклеінавых кіслот. Падчас выкарыстання яны павінны ўдзельнічаць у экстракцыі і лічыцца інфекцыйнымі. З імі варта звяртацца і ўтылізаваць іх у адпаведнасці з адпаведнымі правіламі.
Унутраным эталонным генам з'яўляецца ген RnaseP чалавека.
Умовы захоўвання і тэрмін прыдатнасці
-20±5℃, пазбягайце паўторнага замарожвання і размарожвання больш за 5 разоў, тэрмін прыдатнасці 6 месяцаў.
Прыдатны інструмент
З FAM / HEX / CY5 і іншымі шматканальнымі флуарэсцэнтнымі ПЦР-прыборамі.
Патрабаванні да ўзораў
1. Прыдатныя тыпы ўзораў: мазкі з горла, мазкі з насаглоткі, бронхаальвеалярная вадкасць, мокрота.
2. Збор узораў (асептычная тэхніка)
Мазок з глоткі: працірайце міндаліны і заднюю сценку глоткі двума тампонамі адначасова, затым апускайце галоўку тампона ў прабірку з растворам для ўзяцця пробы.
Мокрота: Пасля таго, як пацыент моцна адкашляецца, збярыце выкашляную мокроту ў прабірку з закручвальнай вечкам, якая змяшчае раствор для адбору проб; вадкасць для бронхаальвеалярнага лаважу: пробы адбіраюцца медыцынскімі работнікамі. 3. Захоўванне і транспарціроўка проб
Узоры для вылучэння віруса і аналізу РНК неабходна праверыць як мага хутчэй. Узоры, якія можна выявіць на працягу 24 гадзін, можна захоўваць пры тэмпературы 4℃; тыя, якія немагчыма выявіць на працягу 24 гадзін...
гадзіны павінны захоўвацца пры тэмпературы -70℃ або ніжэй (калі ўмовы захоўвання не дасягаюцца пры тэмпературы -70℃, іх варта
часова захоўваць пры тэмпературы -20℃ у халадзільніку). Падчас транспарціроўкі ўзоры нельга замарожваць і размарожваць паўторна. Узоры варта адправіць у лабараторыю як мага хутчэй пасля збору. Калі ўзоры неабходна транспартаваць на вялікія адлегласці, рэкамендуецца захоўваць іх у сухім лёдзе.
Метады выпрабаванняў
1 Апрацоўка ўзораў і экстракцыя РНК (зона апрацоўкі ўзораў)
Рэкамендуецца ўзяць 200 мкл вадкага ўзору для экстракцыі РНК. Інфармацыю пра адпаведныя этапы экстракцыі глядзіце ў інструкцыях камерцыйных набораў для экстракцыі РНК. Як адмоўны, так і адмоўны вынік...
Кантрольныя элементы ў гэтым наборы ўдзельнічалі ў экстракцыі.
2 Падрыхтоўка рэагентаў для ПЦР (зона падрыхтоўкі рэагентаў)
2.1 Выміце ўсе кампаненты з набору, размарозьце іх і змяшайце пры пакаёвай тэмпературы. Перад выкарыстаннем адцэнтрыфугуйце пры 8000 абаротаў у хвіліну на працягу некалькіх секунд; разлічыце неабходную колькасць рэагентаў і падрыхтуйце рэакцыйную сістэму, як паказана ў наступнай табліцы:
| Кампаненты | N порцыя (сістэма 25 мкл) |
| Праймер nCOV TaqMan Probemixture | 18 мкл × N |
| Раствор для рэакцыі RT-PCR | 2 мкл × N |
| *N = колькасць правераных узораў + 1 (адмоўны кантроль) + 1 (nCOVстаноўчы кантроль) | |
2.2 Пасля стараннага змешвання кампанентаў адцэнтрыфугуйце на працягу кароткага часу, каб уся вадкасць са сценкі прабіркі апусцілася на дно прабіркі, а затым унясіце аліквоту 20 мкл сістэмы ампліфікацыі ў прабірку для ПЦР.
3 Адбор проб (зона падрыхтоўкі ўзораў)
Пасля экстракцыі дадайце па 5 мкл адмоўнага і станоўчага кантролю. РНК тэставанага ўзору дадаецца ў прабірку для ПЦР.
Шчыльна зачыніце прабірку вечкам і цэнтрыфугуйце пры 8000 абаротаў у хвіліну на працягу некалькіх секунд, перш чым перанесці яе ў зону ампліфікацыі і дэтэктавання.
4 ПЦР-ампліфікацыя (ампліфікаваная зона выяўлення)
4.1 Змесціце рэакцыйную прабірку ў ячэйку для ўзору прыбора і ўсталюйце наступныя параметры:
| этап | Веласіпед колькасць | Тэмпература(°C) | Час | калекцыясайт |
| Рэверстранскрыпцыя | 1 | 42 | 10 хвілін | - |
| Папярэдняя дэнатурацыяn | 1 | 95 | 1 хвіліна | - |
| Веласіпед | 45 | 95 | 15 секунд | - |
| 60 | 30-я гады | збор дадзеных |
Выбар канала выяўлення прыбора: абярыце каналы FAM, HEX, CY5 для сігналу флуарэсцэнцыі. Калі вы не хочаце выкарыстоўваць эталонную флуарэсцэнцыю, не выбірайце ROX.
5 Аналіз вынікаў (калі ласка, звярніцеся да эксперыментальнай інструкцыі кожнага прыбора для налады)
Пасля рэакцыі захавайце вынікі. Пасля аналізу адкарэктуйце пачатковае значэнне, канчатковае значэнне і парогавае значэнне базавай лініі ў адпаведнасці з выявай (карыстальнік можа адрэгуляваць у залежнасці ад рэальнай сітуацыі, пачатковае значэнне можна ўсталяваць на 3~15, канчатковае значэнне можна ўсталяваць на 5~20, карэкціроўка) на лагарыфмічным графіку. На парозе акна лінія парога знаходзіцца ў лагарыфмічнай фазе, а крывая ампліфікацыі адмоўнага кантролю ўяўляюць сабой прамую лінію або ніжэй за лінію парога.
6. Кантроль якасці (у тэст уключаны працэдурны кантроль). Адмоўны кантроль: няма відавочнай крывой ампліфікацыі для каналаў выяўлення FAM, HEX, CY5.
Станоўчы кантроль COV: відавочная крывая ампліфікацыі каналаў дэтэкцыі FAM і HEX, значэнне Ct ≤ 32, але адсутнічае крывая ампліфікацыі канала CY5;
Вышэйпералічаныя патрабаванні павінны быць выкананы адначасова ў адным эксперыменце; у адваротным выпадку эксперымент несапраўдны і яго трэба паўтарыць.
7 Вызначэнне вынікаў.
7.1 Калі ў каналах FAM і HEX тэставага ўзору няма крывой ампліфікацыі або значэнне Ct > 40, а ў канале CY5 ёсць крывая ампліфікацыі, можна меркаваць, што ва ўзоры няма РНК новага каранавіруса 2019 года (2019-nCoV);
.2 Калі тэставы ўзор мае відавочныя крывыя ампліфікацыі ў каналах FAM і HEX, а значэнне Ct ≤40, можна меркаваць, што ўзор станоўчы на новы каранавірус 2019 года (2019-nCoV).
7.3 Калі ўзор для тэставання мае выразную крывую ампліфікацыі толькі ў адным канале FAM або HEX, а значэнне Ct ≤40, а ў іншым канале крывой ампліфікацыі няма, вынікі неабходна праверыць паўторна. Калі вынікі паўторнага тэставання супадаюць, узор можна лічыць станоўчым для новага тэсту.
каранавірус 2019 года (2019-nCoV). Калі вынік паўторнага тэсту адмоўны, можна меркаваць, што ўзор адмоўны на новы каранавірус 2019 года (2019-nCoV).
Пазітыўная каштоўнасць меркавання
Для вызначэння эталоннага значэння CT набору выкарыстоўваецца метад ROC-крывой, а эталоннае значэнне ўнутранага кантролю роўнае 40.
Інтэрпрэтацыя вынікаў тэстаў
1. Кожны эксперымент павінен быць правераны на наяўнасць адмоўнага і станоўчага кантролю. Вынікі тэстаў можна вызначыць толькі тады, калі кантрольныя ўзоры адпавядаюць патрабаванням кантролю якасці.
2. Калі каналы выяўлення FAM і HEX станоўчыя, вынік з канала CY5 (канал унутранага кіравання) можа быць адмоўным з-за канкурэнцыі сістэмы.
3. Калі вынік унутранага кантролю адмоўны, і каналы выяўлення FAM і HEX у прабірцы таксама адмоўныя, гэта азначае, што сістэма адключана або яе праца няправільная, і тэст несапраўдны. Таму ўзоры неабходна праверыць паўторна.
