прадукты
Набор Lifecosm для выяўлення SARS-Cov-2-RT-PCR для 2019-nCoV
Чаканае выкарыстанне
Гэты набор выкарыстоўваецца для якаснага выяўлення новага каранавіруса (2019-nCoV) з выкарыстаннем мазкоў з горла, насаглоткі, бронхаальвеалярнага лаважу, мокроты. Вынік выяўлення гэтага прадукта прызначаны толькі для клінічнай даведкі і не павінен выкарыстоўвацца як адзіны сведчанні для клінічнай дыягностыкі і лячэння. Рэкамендуецца комплексны аналіз стану ў спалучэнні з клінічнымі праявамі пацыента і іншымі лабараторнымі даследаваннямі.
Прынцып агляду
Набор заснаваны на аднаэтапнай тэхналогіі RT-PCR.Фактычна, гены ORF1ab і N новага каранавіруса 2019 (2019-nCoV) былі выбраны ў якасці мэтавых абласцей ампліфікацыі.Спецыяльныя праймеры і флуарэсцэнтныя зонды (зонды гена N пазначаны FAM, а зонды ORF1ab пазначаны HEX) прызначаны для выяўлення РНК каранавіруса новага тыпу 2019 у пробах.У камплект таксама ўваходзіць сістэма выяўлення эндагеннага ўнутранага кантролю (зонд гена ўнутранага кантролю, пазначаны CY5) для маніторынгу працэсу збору ўзораў, ампліфікацыі РНК і ПЦР, памяншаючы тым самым ілжываадмоўныя вынікі.
Асноўныя кампаненты
| Кампаненты | Аб'ём（48T/Камплект) |
| Раствор рэакцыі ОТ-ПЦР | 96 мкл |
| Праймер nCOV Сумесь зондаў TaqMan（ORF1ab, ген N, ген RnaseP） | 864 мкл |
| Адмоўны кантроль | 1500 мкл |
| Станоўчы кантроль nCOV (ген ORF1ab N) | 1500 мкл |
Уласныя рэагенты: рэагенты для экстракцыі або ачысткі РНК.Адмоўны/станоўчы кантроль: станоўчым кантролем з'яўляецца РНК, якая змяшчае мэтавы фрагмент, а адмоўным кантролем з'яўляецца вада без нуклеінавых кіслот.Падчас выкарыстання яны павінны ўдзельнічаць у экстракцыі і павінны лічыцца інфекцыйнымі.З імі трэба звяртацца і ўтылізаваць іх у адпаведнасці з адпаведнымі правіламі.
Унутраным эталонным генам з'яўляецца ген RnaseP чалавека.
Умовы захоўвання і тэрмін прыдатнасці
-20±5℃, пазбягайце паўторнага замарожвання і адтавання больш за 5 разоў, сапраўдны на працягу 6 месяцаў.
Прыдатны інструмент
З FAM / HEX / CY5 і іншым шматканальным люмінесцэнтным прыборам ПЦР.
Патрабаванні да ўзору
1. Дастасавальныя тыпы ўзораў: мазкі з горла, мазкі з насаглоткі, бронхаальвеалярны лаваж, мокрота.
2. Збор узораў (асептычны метад)
Мазок з глоткі: працярыце міндаліны і заднюю сценку глоткі двума тампонамі адначасова, затым апусціце галоўку тампона ў прабірку з растворам для ўзору.
Мокрота: пасля таго, як у пацыента моцны кашаль, збярыце адкашляную мокроту ў прабірку з закручваецца вечкам, якая змяшчае раствор для ўзору;вадкасць бронхаальвеалярнага лаважу: адбор пробы медыцынскімі работнікамі.3.Захоўванне і транспарціроўка узораў
Узоры для вылучэння віруса і тэставання РНК павінны быць правераны як мага хутчэй.Узоры, якія можна выявіць на працягу 24 гадзін, можна захоўваць пры тэмпературы 4 ℃;тыя, якія не могуць быць выяўлены на працягу 24
гадзіны павінны захоўвацца пры -70 ℃ або ніжэй (калі няма ўмоў захоўвання -70 ℃, яны павінны быць
часова захоўваць пры -20℃ у халадзільніку).Варта пазбягаць паўторнага замарожвання і адтавання ўзораў падчас транспарціроўкі.Узоры павінны быць адпраўлены ў лабараторыю як мага хутчэй пасля збору.Калі ўзоры неабходна транспартаваць на вялікія адлегласці, рэкамендуецца захоўваць сухі лёд.
Метады выпрабаванняў
1 Апрацоўка ўзору і экстракцыя РНК (зона апрацоўкі ўзору)
Рэкамендуецца ўзяць 200 мкл вадкага ўзору для экстракцыі РНК.Для адпаведных этапаў экстракцыі звярніцеся да інструкцый камерцыйных набораў для экстракцыі РНК.І адмоўны, і адмоўны
элементы кіравання ў гэтым наборы ўдзельнічалі ў здабычы.
2 ПЦР падрыхтоўка рэагентаў (зона падрыхтоўкі рэагентаў)
2.1 Дастаньце ўсе кампаненты з набору, размарозіце і змяшайце пры пакаёвай тэмпературы.Цэнтрыфуга на 8000 абаротаў у хвіліну на працягу некалькіх секунд перад выкарыстаннем;разлічваюць неабходную колькасць рэагентаў, і рэакцыйную сістэму рыхтуюць, як паказана ў наступнай табліцы:
| Кампаненты | N порцыя (сістэма 25 мкл) |
| Праймер nCOV TaqMan Probemixture | 18 мкл × N |
| Раствор рэакцыі ОТ-ПЦР | 2 мкл × N |
| *N = колькасць правераных узораў + 1 (адмоўны кантроль) + 1 (nCOVстаноўчы кантроль) | |
2.2 Пасля стараннага змешвання кампанентаў адцэнтрыфугуйце на працягу кароткага часу, каб уся вадкасць са сценкі прабіркі апусцілася на дно прабіркі, а затым наліце 20 мкл сістэмы ампліфікацыі ў прабірку для ПЦР.
3 Адбор проб (зона падрыхтоўкі ўзору)
Дадайце 5 мкл адмоўнага і станоўчага кантролю пасля экстракцыі.У прабірку для рэакцыі ПЦР дадаецца РНК узору, які трэба праверыць.
Шчыльна зачыніце прабірку і адцэнтрыфугуйце пры 8000 абаротаў у хвіліну на працягу некалькіх секунд, перш чым перанесці яе ў зону выяўлення ампліфікацыі.
4 ПЦР-ампліфікацыя (узмоцненая вобласць выяўлення)
4.1 Змесціце рэакцыйную трубку ў ячэйку прыбора і ўсталюйце параметры наступным чынам:
| этап | Цыкл лік | тэмпература(°C) | Час | калекцыясайт |
| Рэверстранскрыпцыя | 1 | 42 | 10 хвілін | - |
| Папярэдняя дэнатурацыяn | 1 | 95 | 1 хвіліна | - |
| Цыкл | 45 | 95 | 15с | - |
| 60 | 30-я гады | збор дадзеных |
Выбар канала выяўлення інструмента: Выберыце канал FAM、HEX、CY5 для сігналу флуарэсцэнцыі.Для даведкі люмінесцэнтныя НЯМА, калі ласка, не выбірайце ROX.
5 Аналіз вынікаў (Калі ласка, звярніцеся да эксперыментальных інструкцый кожнага прыбора для наладкі)
Пасля рэакцыі захавайце вынікі.Пасля аналізу адрэгулюйце пачатковае значэнне, канчатковае значэнне і парогавае значэнне базавай лініі ў адпаведнасці з выявай (карыстальнік можа наладзіць у адпаведнасці з рэальнай сітуацыяй, пачатковае значэнне можа быць усталявана ў 3~15, канчатковае значэнне можа быць усталявана ў 5~20, карэкціроўка) на лагарыфмічнай графіцы На парозе акна парогавая лінія знаходзіцца ў лагарыфмічнай фазе, а крывая ампліфікацыі адмоўнага кантролю - прамая лінія або ніжэй парогавай лініі).
6 Кантроль якасці（Працэдурны кантроль уключаны ў тэст） Адмоўны кантроль: Няма відавочнай крывой ампліфікацыі для каналаў выяўлення FAM, HEX, CY5n
Станоўчы кантроль COV: відавочная крывая ампліфікацыі каналаў выяўлення FAM і HEX, значэнне Ct≤32, але няма крывой ампліфікацыі канала CY5;
Вышэйпаказаныя патрабаванні павінны выконвацца адначасова ў адным і тым жа эксперыменце;у адваротным выпадку эксперымент несапраўдны і яго трэба паўтарыць.
7 Вызначэнне вынікаў.
7.1 Калі няма крывой ампліфікацыі або значэння Ct> 40 у каналах FAM і HEX доследнага ўзору, і ёсць крывая ампліфікацыі ў канале CY5, можна меркаваць, што новага каранавіруса 2019 (2019-nCoV) няма. РНК ва ўзоры;
.2 Калі тэставы ўзор мае відавочныя крывыя ампліфікацыі ў каналах FAM і HEX і значэнне Ct складае ≤40, можна меркаваць, што ўзор станоўчы на новы каранавірус 2019 (2019-nCoV).
7.3 Калі тэставы ўзор мае выразную крывую ампліфікацыі толькі ў адным канале FAM або HEX, а значэнне Ct складае ≤40, а ў іншым канале няма крывой ампліфікацыі, вынікі неабходна праверыць паўторна.Калі вынікі паўторнага тэсту адпавядаюць, узор можна лічыць станоўчым для новага
каранавірус 2019 (2019-nCoV).Калі вынік паўторнага тэсту адмоўны, можна меркаваць, што ўзор адмоўны на новы каранавірус 2019 (2019-nCoV).
Станоўчае значэнне суджэння
Метад крывой ROC выкарыстоўваецца для вызначэння эталоннага значэння CT набору, а эталоннае значэнне ўнутранага кантролю роўна 40.
Інтэрпрэтацыя вынікаў аналізаў
1. Кожны эксперымент павінен быць правераны на адмоўны і станоўчы кантроль.Вынікі выпрабаванняў могуць быць вызначаны толькі тады, калі кантроль адпавядае патрабаванням кантролю якасці
2.Калі каналы выяўлення FAM і HEX станоўчыя, вынік з канала CY5 (унутраны канал кіравання) можа быць адмоўным з-за сістэмнай канкурэнцыі.
3. Калі вынік унутранага кантролю адмоўны, калі каналы выяўлення FAM і HEX прабіркі таксама адмоўныя, гэта азначае, што сістэма адключана або аперацыя няправільная, т тэст несапраўдны.Такім чынам, узоры неабходна правяраць паўторна.
